کلونینگ و ارزیابی بیوانفورماتیکی ژن مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (mdhar) در گیاه آلوروپوس لیتورالیس و بررسی بیش بیان آن در گیاه توتون (nicotina tobacum)

شوری خاک یکی از مهم­ترین عوامل غیرزنده­، با برهم زدن شرایط مطلوب است که سبب بروز اختلالات متابولیسمی در سلول‏های گیاهی، از جمله افزایش تولید انواع گونه­های اکسیژن فعال (ros) می­گردد .مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (mdhar) یکی از آنزیم‏های کلیدی در مسیر گلوتاتیون-آسکوربات است که نقش احیاکنندگی رادیکال‏های مونودهیدروآسکوربات را بر عهده دارد. در تحقیق حاضر آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز، از گیاه هالوفیت آلوروپوس لیتورالیس (aeluropus littoralis) شناسایی، جداسازی و هم سانه­سازی گردید و به گیاه توتون انتقال داده شد. برای این منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پایگاه ncbi، پرایمرهای مناسب طراحی و با روش rt-pcr توالی ژنی مذکور تکثیر و به منظور توالی یابی در وکتور ptz57r/t درون باکتری ای.کلای (dh5α) هم سانه­سازی شد. سپس به منظور انتقال به گیاه توتون، با آنزیم pfu دی. ان. آ. پلیمراز تکثیر گردید. پس از الحاق پروموتر و ترمیناتور 35s به ناقل بیانی pgreen0029، توالی ژنی mdhar نیز به این ناقل وارد شد و سازه­ی نوترکیب به سلول­های اگروباکتریوم نژاد lba4404 ترانسفورم شد و برای تراریخت­سازی توتون به روش دیسک برگی مورد استفاده قرار گرفت. از گیاهان باززایی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی­بیوتیک کانامایسین استخراج dna و سپس rna صورت گرفت و آزمون­های pcr و rt-pcr انجام شد. آزمون pcr با dna گیاهان انتخابی نشان داد توالی ژنی mdhar به سلول­های گیاهان تراریخت وارد شده و بیان مستمر این ژن نیز توسط آزمون rt-pcr تأیید شد. بررسی­های بیوانفورماتیکی روی ژن نشان داد که ژن mdhar شامل 1436 جفت باز و فاقد نواحی اینترونی است. مقایسه­ی توالی به دست آمده با توالی­های سایر mdhar­های گیاهی ثبت شده در بانک ژن، بیانگر شباهت بالای این ژن با سایر mdhr­های جدا شده از گیاهان خانواده­ی گندمیان بوده که با mdhar­ سورگم (sorghum bicolor)، بیشترین شباهت را داشت. آنالیز ساختار پروتئینی، بین سلولی بودن و نواحی موتیف pyr-redoxin و sdr را اثبات کرده و نیز بررسی ساختار ثانویه، نشان­دهنده­ی 3/78 درصد ساختار مارپیچ آلفا، 1/41 درصد ساختار چین خورده ی بتا و 6/13 درصد ساختار دور بتا یا دور معکوس بود.